Red Retrobeads IX Lumafluor逆向示蹤紅色熒光微粒使用注意事項

RetroBeads™逆向示蹤熒光微粒是Lumafluor 公司特色的逆向示蹤產品，且是目前文獻證實有效的示蹤微粒（該產品的有效性經數百篇從無脊椎動物到哺乳動物實驗的研究論文證實），  該示蹤產品體內注射高度集中不易擴散，信號強，對活細胞或活體無毒，且存留時間大于一年，與大多順向示蹤劑、原位雜交檢測技術、免疫組化技術兼容。

Lumafluor紅色 Red RetroBeads操作說明

一、包裝與稀釋：

  Lumafluor 的beads包裝于一支密封的小管內，內含的濃縮beads懸浮于蒸餾水中。如使用紅色Beads作為神經通路的逆向示蹤，其稀釋方法推薦采用：大鼠視皮層內可采用1：4比例進行稀釋而不減少Beads的熒光標記強度和質量。然而對于實驗我們不推薦使用稀釋的Beads而使用原液進行注射示蹤。除蒸餾水外，常規的鹽溶液如NaCl、KCl溶液也可作為稀釋液。如使用綠色Beads，則強烈建議使用原液，無需稀釋。

二、溫度儲存:

   為避免蒸發，Bead溶液應存放于冰箱內4度冷藏，切忌勿冷凍！ 冷凍的Beads將失去效用，無法使用。而變干的beads同樣也無法使用（無法重懸），該產品建議一年內用完。

三、注射：

   Beads使用壓力注射，如1 mlHamilton微量注射器或氣壓注射系統，如需小區域微量注射(30-50 nl)，可采用末端30-50 um直徑的玻璃電極注射，而常規的逆向示蹤（注射量0.1-0.3 ul）可使用更大直徑的玻璃電極。盡管如此，即使注入更大的劑量，Beads，也不會明顯從注射位點擴散（通常擴散距離少于1mm），因此，為盡量充分標記投射到一個較大神經核團的神經元，需使用多點注射。盡管Beads帶有負電荷，但是不建議采用離子滲透法注入示蹤Beads。

四、存活時間：

   在大多數恒溫脊椎動物系統中，檢測Beads的時間推薦為1周。目前并未檢測Beads的zui長可檢測期，然而在Beads的熒光強度和質量至少可保持在體內14個月以上不變，而細胞可能會被yongjiu標記。目前并未發現Beads在動物或神經元中表現出毒性作用的報道。

五、固定和處理：

   準的固定方法是：0.1 M PBS沖洗或灌注后在4%的多聚甲醛（0.1 M PBS配制，pH 7.4）中固定，用戊二醛固定會產生大量的組織自發熒光，妨礙Beads標記的神經元，并且綠色Beads在戊二醛固定的組織中將根本觀察不到，因此應盡量避免采用。如采用冰凍切片，切片應用PBS漂洗后用明膠包被的載玻片貼片晾干，在充分風干后，再用二甲苯透明1分鐘，然后用熒光封片劑（Fluoromount或Krystalon）封片。Fluoromount可從Atomergic Chemetals Corp., （Farmingdale, NY）公司購買; Krystalon可從Harleco (EM Industries，Gibbstown, NJ）購買（靶點科技有售）。切片只可短期暴露在乙醇或二甲苯中，但是長時間暴露（大于5分鐘）會損壞Beads。Beads 對甘油非常敏感，在甘油環境中熒光會迅速萃滅，因此切忌使用甘油類封片劑，如無法避免，還可采用水楊酸甲酯代替甘油作為封片劑。封片后的切片如存放于黑暗環境中，熒光Beads標記的細胞可保持一年不萃滅（但是切片的自身熒光背景會增加）。迄今為止，還沒有成功采用塑膠材料包被Beads標記的組織的記錄。

六、成像觀察:

   紅色Beads中的染料為羅丹明，因此所有與羅丹明匹配的熒光濾鏡均可使用，部分老的尼康公司的羅丹明濾鏡因背景較高，可能導致無法觀察到熒光Beads，通常Zeiss 和Leitz的標準羅丹明濾鏡可獲得較好的觀察效果。而大多綠色熒光濾鏡均可較好地觀察綠色Beads的熒光結果，設置為熒光黃的濾鏡可獲得較強的明亮熒光，但是同時也帶來較高的背景干擾。較寬波段的熒光濾鏡比窄波段的熒光濾鏡可以獲得更強的熒光信號。在長時間的觀察和拍照下Beads的熒光也不會淬滅。

 在低倍數或低數值孔徑物鏡下(如 X4, X10)通常難以觀察到Bads的熒光信號，只有細胞被顯著標記，X10的油鏡（數值孔徑大于0.4）或者更大倍數的物鏡才可觀察到。通常情況下，X 25的油鏡可以清晰地觀察到低倍鏡下無法觀察到的標記細胞。物鏡的選用對綠色熒光Beads尤其重要。在做出實驗失敗的決定前（在目標區域無法觀察到標記細胞），可先用油鏡仔細觀察注射位點附近的細胞是否被標記，此處應該觀察到大量的標記細胞。

  對使用綠色熒光Beads標記的額外提醒：目前已發現綠色熒光Beads在年青動物比年老動物中標記更為理想的情況，此外，年青動物的組織自發熒光（背景）也更低，因此，假如可以的話，在使用綠色熒光Beads做逆向標記實驗時請盡量使用年輕動物。

  因為綠色熒光Beads的激發光段比紅色熒光Beads短，因此組織自發熒光是個問題，因此，應采用減少自發熒光的步驟以獲得更理想的實驗結果，這些方法有：（1）使用更薄的切片，如30微米比40或50微米理想；（2）使用年青的動物；（3）封片后立即觀察拍照（隨著時間增加背景也會增加）。